O procedimento de ISTD elimina as desvantagens do método ESTD adicionando uma quantidade conhecida de um composto que serve de fator normalizador. Esse composto, o padrão interno, é adicionado tanto às amostras desconhecidas como às amostras de calibração.
O composto utilizado como padrão interno deve ser similar ao composto calibrado, tanto quimicamente como em tempo de retenção/migração, mas deve ser diferenciável cromatograficamente.
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Vantagens |
Desvantagens |
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A variação no tamanho da amostra não é fundamental. A oscilação do instrumento é compensada pelo padrão interno. Os efeitos de preparações de amostras são minimizados se o comportamento químico do ISTD e da amostra desconhecida forem similares. | O padrão interno deve ser adicionado a todas as amostras. |
Se o procedimento de ISTD for utilizado para calibrações com uma característica não linear, deve-se tomar cuidado para que erros resultantes do princípio de cálculo não causem erros sistemáticos. Em calibrações multinível, a quantidade do composto de ISTD deve ser mantida constante, ou seja, a mesma para todos os níveis.
Na análise do padrão interno, a quantidade do composto de interesse está relacionada à quantidade do componente do padrão interno pela razão das respostas dos dois picos.
O OpenLab CDS permite até 5 compostos de ISTD.
Para o cálculo do ISTD, são utilizadas respostas relativas e quantidades relativas em vez das respostas e quantidades "brutas". Elas são calculadas dividindo a resposta e a quantidade do pico de interesse pela resposta e quantidade do composto de ISTD correspondente:
Resposta relativa = Resposta / Resposta ISTD
Quantidade relativa = Quantidade / QuantidadeISTD
A resposta pode ser Área, % Área, Altura ou % Altura (consulte Tipo de resposta e fator de resposta).
Em uma calibração ISTD, o cálculo da razão de quantidade corrigida de um composto em particular em uma amostra desconhecida ocorre em vários estágios. Esses estágios são descritos nas seções a seguir.