Para correr uma Calibração de Atraso, você deve criar um método que identifique todos os módulos a serem incluídos no sistema calibrado e que contenha as seguintes informações:
Informações da amostra (local, nome etc.)
Informações de configuração e corrida para cada um dos módulos (Amostrador, Bomba, Detector etc.)
O procedimento de Calibração de Atraso deve ser realizado com as configurações do método o mais parecidas possível da aplicação-alvo para evitar possíveis problemas. É aconselhável usar as mesmas configurações do Modulador de Fluxo (modo split) que na aplicação-alvo para evitar problemas inesperados. Caso o sinal seja muito baixo no(s) detector(es) do fluxo split, o modo split deve ser ajustado para um valor mais próximo do Modo 1.
Importante: O(s) tempo(s) e o(s) volume(s) de atraso que foram medidos para os detectores nos fluxos split só serão válidos para esta combinação de fluxos principal e makeup. Apenas o(s) tempo(s) e o(s) volume(s) de atraso calibrados para os detectores no fluxo principal serão recalculados dependendo da vazão real.
A calibração com o calibrante de atraso e verificação não pode ser realizada de forma isocrática. Alguns corantes na mistura não eluirão adequadamente da coluna quando for usada uma alta porcentagem de solvente orgânico. Este é um efeito específico dos corantes sulfonados que são separados com colunas de área de superfície alta, típicas da cromatografia preparativa.
Antes da primeira corrida, lave a coluna com três volumes de coluna usando o canal B orgânico a 95% (cerca de 2 minutos).
A tabela abaixo lista os volumes de injeção padrão sugeridos do Calibrante de atraso e verificação Agilent (part number 5190-8223) para diferentes diâmetros de coluna. Se necessário, ajuste o volume de injeção caso a resposta final no detector ou no sensor de atraso do coletor de frações esteja saturada ou muito baixa.
Diâmetro interno da coluna | Volume de injeção do calibrante |
|---|---|
3,0 mm | 0,5 μL |
4,6 mm | 1 μL |
cerca de 10 mm | 10 μL |
cerca de 20 mm | 50 μL |
30 mm | 100 μL |
50 mm | 300 μL |
Se o sistema contiver um amostrador/coletor open-bed preparativo 1290 Infinity II (G7158B), mude o modo de operação para Preparativo no método do amostrador. A partir da lista de predefinições do método, selecione a predefinição para Matriz de Amostra Não Polar. Nas configurações do plug à direita, forneça um local para um vial de metanol a 25% em água, que serve como solvente de plug pós-amostra. Deixe todos os outros parâmetros na sua configuração padrão.
O sistema de LC foi entregue com, pelo menos, um kit capilar projetado para uma determinada faixa de fluxo. Dependendo dos capilares instalados, são recomendadas as combinações de colunas e taxas de fluxo a seguir.
Diâmetro interno da coluna | Faixa de taxa de fluxo | Coluna entregue com o sistema |
|---|---|---|
3,0 mm | 0,4–0,6 mL/min | 3,0 × 50 mm, 2,7 μm (699975-302) |
4,6 mm | 1,0–1,5 mL/min | 4,6 × 100 mm, 2,7 μm (695975-902) |
cerca de 10 mm | 4–8 mL/min | 10 × 50 mm, 5 μm (446905-802) |
cerca de 20 mm | 15–40 mL/min | 21,2 × 50 mm, 5 μm (446905-702) |
30 mm | 40–80 mL/min | 30 × 50 mm, 5 μm (446905-302) |
50 mm | 80–200 mL/min | 50 × 50 mm, 5 μm (446905-502) |
Se o split passivo do kit de tubos estiver incluído no volumizador antes do nebulizador, o fluxo makeup sugerido é de 1,5 mL/min.
Se o split passivo do kit de tubos não for usado, o fluxo makeup sugerido é de 0,5 mL/min. A taxa de fluxo máxima para a fonte ESI é de 0,8 mL/min.
Recomenda-se usar o gradiente a seguir com as colunas de 50 mm de comprimento incluídas nos kits capilares do sistema de escala preparativa. Se forem usadas colunas mais longas para a calibração, estenda o tempo de slope do gradiente por um fator adequado. O gradiente é adequado para qualquer diâmetro interno da coluna, desde que a taxa de fluxo seja ajustada em conformidade.
Tempo | Composição A | Composição B |
|---|---|---|
Tempo de precondicionamento: 1,5 min | ||
0 min | 90% | 10% |
0,5 min | 90% | 10% |
4,0 min | 5% | 95% |
6,0 min | 5% | 95% |
6,1 min | 90% | 10% |
Tempo final: 7,0 min | ||
Caso o cromatograma apresente picos ou picos unidos em uma banda semelhante a um pico, tente aumentar a composição inicial de 10% para 20%.
UV | Use um comprimento de onda de 600 mm (sem comprimento de onda de referência) para monitorar o corante de calibração azul do calibrante de atraso e verificação. |
MS | Íons visíveis para o corante de calibração azul:
|
base-id: 12676512523
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